DESI-MSI法によるApoE-/-マウスの大動脈組織におけるオメガ-3脂肪酸のNAD+濃度上昇の発見

本研究では、PUFAsの短期投与によるNAD+、FAD+およびその代謝物の薬物動態を評価し、EPA DHAの独立した有効性を明らかにしました。非破壊的なMSI技術であるDESI-Imagingを用いて、大動脈弓に存在する低分子をピックアップしています。

背景

NAD+は、1906年にArthur Hardenが酵母の発酵速度を高める補酵素として初めて発見した、エネルギー伝達や生合成過程の電子移動に関与する万能な分子です。これは、2つのヌクレオチドがリン酸結合で結合したもので、1つのヌクレオチドにはアデニン核酸塩基とニコチン酸アミド塩基が含まれています。

質量分析イメージング(MSI)は、化合物の空間分布や質量を決定するための強力なツールです。脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI)は、ソフトイオン化と呼ばれ、帯電した溶媒のジェットを使用して、サンプル表面に微小液滴を注入し、大気圧で気相にイオンを脱離します。DESI-MSIは、極性が高く、不揮発性で、質量の小さい化合物に適用されますが、現在、哺乳類組織におけるNAD+のイメージングに本技術を用いることはまだ報告されていません。

ソリューション

1. 化合物中のNAD + イメージングの可視化

質量電荷比(m/z)50-1200の範囲をスキャンし、NAD+化合物を標準物質としてDESI-IMSテストを実施しました。また、NAD+のイオン化を高めるために、メタノールと水の勾配比を用い、スプレー溶媒を最適化しました。すべての実験は、スペクトルの信頼性と再現性を評価するために、同一条件下で3回繰り返しました。

NAD+の最大イオン化は、98%メタノールをスプレー溶媒として使用した場合に認められました(図2B)。プロトン付加体[M -H]-を持つ目的のイオンは、グループ全体でm/z 662.10に観察されました(図2C)。このピークは、質量に基づいてNAD+に対応しました。

2. 組織切片上でのNAD +/NADH, NADP +/NADPH,FAD +/FADH レドックスカプセルの光観察

NAD+/NADHの非リン酸化アデニンジヌクレオチドとNADP+/NADPHのリン酸化アデニンジヌクレオチドリン酸は、細胞の酸化還元状態を決定する大きな要因となっています。その比率は、特に多くの酵素の活性に影響しており、解糖系酵素を構成する重要な因子です。

生理的および病理的な状況において、これらの補酵素の分布にn-3脂肪酸サプリメントの障害があるかどうかを評価するために、15個の血管(大動脈弓)サンプルをDESI-IMS法を用いて実施しました。その結果、4つのプロトン化イオンが、その局所環境からNAD+(アミド型)、NADH、NADP+、NADPH、NAAD(デアミド-NAD)、NAMと判定されました、

H&E画像(図3A)により、動脈セグメントの輪郭パターンを見ることができます。図3Bに示すように、32週齢のマウスでは、特にDHAまたはEPAの短期投与(3週間)後に、NADおよびFAD代謝物が大動脈壁上に偏在していることが実証されました。赤色領域はイオン分子がより集積していることを表し、青色領域はこれらの領域がより集積していないことを示しています。

DESIイメージング(図3B)は、個々のイオン(内因性代謝物) の 地形図であり 、 NAD+-NADH 、 NADP+-NADPH、FAD+-FADHを区別することができます。このような情報は、他のMSIアプローチによる従来の試料調製や抽出では失われることが多いものです。特に、NAD+、FAD+、およびそれらの代謝物のイオン分布は、WT検体では均一であったのに対し、ApoE-/-マウスの病変部では血管壁全体に散在したり、凝集したりしていることが確認されました。NAADは、NAD+の補給の効果を評価するための感度の高いバイオマーカーである。

サマリー

• DESI-MSIは、NAD+だけでなく、レドックスカップルも同時に検出できる有効な技術であることがわかった。

参考文献

1. Chi, D. H. et al. NAD+ Levels Are Augmented in Aortic Tissueof ApoE−/− Mice by Dietary Omega-3 Fatty Acids. Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology 42, 395-406 (2022).